Pages

Subscribe:

Wednesday, 18 June 2014

PANDUAN PRAKTIKUM BIOLOGI TANAH , fakultas pertanian , universitas udayana



I. STERILISASI PERALATAN LAB DAN BAHAN
1.1 Pendahuluan        
Sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Cara sterilisai dapat dibagi atas tiga jenis utama , yaitu menggunakan panas , bahan kimia , dan peyaringan. Strelesasi menggunakan panas dapat dibagi  atas dua metode , yaitu sterilisasi panas lembab dan serilisai panas kering. Sterilisasi panas lebab dan penyaringan umumnya digunakan untuk bahan, sedangkan sterilisai peraltan LAB dilakukan dengan metode panas dan pengunaan bahan kimia.
            Sterilisasi panas basah dilakukan dengan autoklaf pada tekanan 15 psi pada suhu 120oC selama 20 menit. Pnas yang dilepaskan mampu mendenaturasi atau mengkoagulasikan protein yang terkandung didalam tubuh jasad mikro. Oleh karena itu, metode panas lembab sangat efektif membunuh jasad mikro pada suhu yang tidak terlalu tinggi. Metode ini biasannya digunakan untuk medium buatan, larutan, fisiologis, akuadest, dan pealtan lab.
            Sterilisasi panas kering biasannya digunkan untuk mensterilisasikan perlatan dari bahan pecah-belah , jarum suntik, atau bahanyang tidak daat ditembus uap air, seperti gliserin, minyak , vasein, dan bahan-bahan dalam bentuk serbuk. Suhu yang umum digunakan dalam metode ini adalah 170oC slama 1jam atau 160oC selama 2 jam.
            Sterilisai peralatan lab dengan bahan kimia, umumnnya digunakan larutan sublimate 0,1% dan larutan fenol 2% atau larutan Lysol. Dalam menggunakan bahan-bahan ini perlu diperhatikan agar tidak terdapat sisa-sisa bahan kimia tersebuat pada alat, karena bahan-bahan tersebut dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan jasad mikro yang diteliti.
            Peralatan gelas, seperti pipet dapat disterilisasikan secara cepat melalui pencucian dengan mengunakan larutan fenol 5% kemudian dengan larutan alkohol pekat, dan terakhir dengan ether. Ether yang masih tertinggal pada alat keringan dengan cara memanggang alat secara hati-hati diatas api.
            Metode sterilisasi sederhana yang juga bisa dilakukan , antara lain pasteurisasi dengan pemanasan pada suhu 70oC, pembakaran jarum ose  diatas api bunsen sampai bahan yang melekat dibakar menjadi abu dan dibersihkan dengan kain halus, atau penggunaan alkohol, serta pencucian dengan deterjen.

1.2 Peralatan Dan Bahan
             Peralatan yang dgunakan adalah autoklaf, oven, cawan petri dan pipet. Bahan-bahan yang akan disterilisasikan seperti media tumbuh dan larutan fisiologis.
1.3 Cara Kerja Metode Panas Lembab
1.      Tuangkan air secukupnya kedalam autoklaf.
2.      Masukkan peralatan dan bahan-bahan yang akan disterilisasikan kedalam autoklaf ditata sedemikian rupa agar terdapat cukup ruang bagi peredaran udara/uap didalam autoklaf.
3.      Tutup autoklaf dengan cara memasukkan tabung pebgeluaran gaskedalam saluran pengarah pada dinding bagian dalam autoklaf, diikuti dengan mempertemukan masing-masing buat pengunci luar pada tepi autoklaf dan penutupnnya.
4.      Angkat masing-masing baut pengunci dan kencangkan setiap mur pada arah diagonal secara bersama sampai seluruh mur tertutup rapat.
5.      Panaskan autoklaf dan buka pengantur klep pengaman.
6.      Setelah terdengar suara mendesis yang menunjukkan uap air keluar dengan deras, tutup kembali klep pengaman sehingga tekanan dalam tabung autoklaf meningkat.
7.      Bila tekanan 15 psi telah tercapai (suhu sekitar 121oC) pertahankan tekanan selama 20 menit dengan megatur besarnya api pemanasan.
8.      Pada akhir proses sterilisasi, matikn pemanas dan tunggu sampai tekanan kembali nol, kemudian buka katup pengaman untuk mengeluarkan sisa-sisa uap air yang tersisa didalam autoklaf.
9.      Setelah dingin, kendurkan mur-mur dan buka tutup autoklaf seta keluarkan peralatan dan bahan-bahan yang telah disterilisasi.
10.  Buang sisa air yang ada di dalam autoklaf, kemudian keringkan dan tutup kembali autoklaf.

1.4  Metode Panas Kering.
1.      Tempat kan peralatan ( cawan petri dan pipet) yang akan di sterilkan didalam oven.
2.      Nyalakan oven dan atur suhu pada 160oC,
3.      Matikan oven setelah suhu 160oC diperhatikan selama 2 jam.
4.      Setelah dingin, pindahkan peralatan yang disertai kedalam wadah penyimpanan.


II. PEMBUATAN SERI PENGENCERAN

2.1 Pendahuluan
Dalam penetapan populasi jasad mikro tanah. Perlu dilakukan seri penenceran, karena pupolasi didalam tanah sangat tinggi. Larutan pengenceran yang sering digunakan adalah larutan fisiologis (8,5 g NaCl L-1 akuades). Larutan pengencer yang juga sering digunakan adalah larutan 0,1 % proteosepepton. Penggunaan akuades sebagai lautan pengenceran sebaiknnya dihindari, karena dapat menggangu bahkan membunuh jasad mikro akibat dari perbedaan tekanan osmosis yang cukup besar antara tekanan di dalam sel dengan tekanan diluar sel.
Tingkat pengenceran ditentukan sesuai dengan perkiraan populasi jasad mikro di daam tanah. Semakin subur tanah yang damati, maka perkiraan populasi jasad mikro semakin tinggi  sehingga tingkat pengenceran yag diperlukan akan semakin tinggi. Untuk penetapan jumlah jasad mikro total, biasannya digunakan pengenceran seper 10-4 sampao 109 ( biasannya di tulis 10-4 dan 10-9).

2.2 Peralatan Dan Bahan.
            Peralatan yang diperlukan adalah laminair flow, erlenmeyer, tabung reaksi, pipet dan lampu bunsen. Bahan yang dugunakan adalah larutan fisiologis (lampiran 1), alkohol, dan spiritus.

2.3 Cara Kerja.
1.      Masukkan 10g tanah sampel ke dalam 90 mL larutan fisiologis yang ditempakan dalam erlenmeyer 250 mL steril, lalu dikocok selama 15 menit, sehingga diperoleh suspensi tanah dengan tingkat pengenceran 10 kali yang biasa ditulis 10-1. Kode ini ditulis pada tabung reaksi untuk menghindari kekeliruan.
2.      Pipet 1 mL suspensi tanah dari 10-1  ke dalam 9  mL. Larutan fisiologis dalam tabung reaksi yang telah disetrika sehingga diperoleh suspensi pengenceran 100 kali atau    10-2.
3.      kocok secara merata suspensi tanah tersebut, kemudian pipet 1 mL suspensi tanah dari kepekatan 10-2 kedalam 9 mL. Larutan fisiologis dalam tabung reaksi singga diperoleh suspensi dengan kepekatan 10-3. Harap diperhatikan agar selama pengocokan, kapas penutup tabung reaksi tidak terkena suspensi jasad mikro.
4.      Lakukan tahapan seri pengenceran tesebut sampai diperoleh kepekatan sebesar 10-9 seperti diperlihatkan gambar 1.




 

























III. PENETAPAN JUMLAH JASAD MIKRO TANAH TOTAL.

3.1 Pendahuluan
            Jumlah jasad mikro total yang terdapat didalam tanah dapat digunakan sebagai penduga status kesuburan tanah, tanpa mempertimbangkan hal-hal lain. Memang tanah yang subur mengandug jumlah jasad mikro yang tinggi. Popilasi yang tinggi ini mengggambarkan adanya suplai makanan dan energi yang cukup, an kondisi ekologi yang mendukung perkembangan jasad mikro tersebu didalam tanah. Akan tetapi, dua jenis tanah yang mempunyai jumlah atau kegiatan jasad mikro yang sebnading dapat mempunyai tingkat produktivitas yang berbeda karena tingkat kesuburannnya berbeda.
            Jumlah jasad mikro total sangat berguna dalam menentukan tempat jasad mikro dalam hubungan dengan sistem perakaran, sisa bahan oerganik, dan kedalam profil tanah. Data ini juga berguna dalam membandingkan keragaman iklim dan pengolahan tanah terhadap aktivitas jasad mikro di dalam tanah.
            Metode yang sering digunakan untuk menetapkan jumlah jasad mikro total di dalam tanah adalah metode agar-cawan. Pada prinsipnya, cara ini dimulai dengan pembuata larutan tanah atau bahan lain yang mengandung sel jasad mikro, spora, atau potongan miselium, yang mempunyai kemungkinan untuk tumbuh dan berkembang cukup baik, bila keadaan lingkungan memungkinkan. Suspesi yang diamati didapat dengan membuat seri pengenceran. Oleh karena itu, metode agar-cawan ini sering disebut sebagai cawan pengenceran (dilution plate) atau penghitung mikro dengan pengenceran (dilution count).
            Asumsi utama dari metode ini adalah bahwa tiap jasad mikro yang hidup dalam suspensi tanah dapat berkembang membentuk suatu koloni jika keadaan lingkungan memungkinkan. Kenyataan menunjukkan bawha tidak semua jasad mikro dapat tumbuh pada media agar-cawan, dari jumlah jasad mikro total yang benar-benar ada. Metode ini dapat digunakan dengan baik untuk membandingkan populasi jasad mikro tanah yang satu dengan tanah yang lainnya.
3.2 Peralatan Dan Bahan
            Peralatan yang  diperlukan dalam praktikum ini adalah laminair flow, erlenmeyer, tabung reasi, cawan petri, pipet, dan lampu bunsen. Bahan yang diperlukan adalah larutan fisiologis, media bacto agar(lampiran 2), dan alkohol.
3.3 Cara Kerja.
1.      Siapkan seri pengenceran tanah sampai 10-7.
2.      Pipet masing-masing 1 mL suspensi tanah dari tingkat pengenceran 10-7, 10-6, dan 10-5 kedalam cawan petri yang telah disterilkan. Jangan lua memberi kode pada cawan petri dengan mencantumkan : nama kelompok, nomor contoh/perlakuan, tingkat pengenceran, tanggal inkubasi, dan media yang digunakan, seperti pada gambar 2.
3.      Tuangkan media agar yang telah disiapkan (temperatur 40-45oC) kedalam cawan petri sebanyak 10-15 mL, kemudian secara perlahan-lahan diputar kearah kanan dan kiri masing-masing sebanyak 3 kali.
4.      Diamkan sampai media agar memadat, kemudian inkubasikan pada inkbator selama satu minggu dalam keadaan terbalik untuk menghindari pengembunan pada tutup cawan petri.
5.      Pengamatan dilakukan dengan mencatat jumlah koloni yang tumbuh dan hitung jumlah populasi jasad mikro total dengan rumus :

Jumlah jasad mikro    = [( p1 : 100) + (p2 : 10) + (p3)]  x 107 x (100 + KA)
Total (spk g-1 tanah)                        3                                                 100

Keterangan :
Spk           : satuan pembentuk koloni
P1  :  jumlah koloni pada sampel pengenceran 10-7
P2  : jumlah koloni pada sampel pengenceran 10-6
P3  : jumlah koloni pada sampel pengenceran 10-5
KA           : kadar air tanah









Gambar 2. Informasi yang harus dicantumkan pada cawan petri
 
 



 

3.4 Hasil Dan Pembahansan




IV PENETAPAN POPULASI JASAD MIKRO SELULOLITIK

4.1   Pendahuluan
Selulose merupakan komponen terbesar penyusun jaringan tumbuh. Senyawa organik tersebut  umumnya tidak  udah dimanfaatkan oleh jasad ,ikro tanah. Beberapa jasad mikro mempunyai kemampuan untuk merombak selulose menjadi senyawa organik sederhana, sehingga dapat dimanfaatkan oleh jasad mikro lainnya. Jasad mikro selulolitik. Isolasi jasad mikro tersebut dilakukan dengan menggunakan media semi selektif dengan selulose sebagai satu-satunya sumber karbon.
Salah satu media yang sering digunakan untuk mengisolasi jasad mikro sesulolitik adalah media CMC ( carboxy-methyk cellulose) penambah larutan phenol red dipermukaan media tersebut pada akhir pengamatan perlu dilakuan untuk membedakan jaad mikro selulolitik dengan jasad mikro yang tidak mampu merombak selulose. Koloni jasad mikro sesulotik pada media CMC yang ditambahkan phenol red memiliki zone terang disekitas koloni.
4.2   Peralatan Dan Bahan.
Peralatan yang diperlukan dalam praktikum ini adala laminair flow, erlenmeyer, tabung reaksi, cawan petri, pipet, dan lampu bunsen. Bahan yang diperlukan adalah larutan  fisiologis, media CMC (lampiran 3), dan alkohol.
4.3  Cara Kerja
1.      siapkan seri penganceran tanah sampai 10-6.
2.      Pipet masing-masing 1 mL suspensi tanah dari tingkat pengenceran 10-6, 10-5, dan 10-4 kedalam cawan petri yang telah disterilkan dan jangan lupa memberi kode pada cawan petri dengan mencantumkan :  nama kelompok, nomor contoh/perlakuan, tingkat pengenceran, tanggal inkubasi dan media yang digunakan, seperti gambar 2.
3.      Tuangan media CMC yang telah disiapkan ( temperatur 40-45oC) kedalam cawan petri sebanyak 10-15 mL, kemudian secara perlahan-lahan diputar kearah kanan dan kiri masing-masing 3 kali.
4.      Diaman sampai media aga memadat, kemudian inkubasikan pada inkubator selama 1 minggu dalam keadaan terbalik untuk menghindari pengembunan pada tutup cawan petri.
5.      Pada akhir inkubasi, tuangkan phenol red sampai menutupi permukaan agar diamkan sejenak.
6.      Pengamatan dilakukan dengan mencatat jumlah koloni yang memilih tempat terang disekelilingnya dan hitung jumlah populasi jasad ikro selulolitik dengan rumus :
Jumlah jasad mikro = [ (P1 : 100)  +  (P2 : 10) + (P3) ] X 106 X (100 + KA )
Total(spk g-1tanah)                             3                                              100


Keterangan :
Spk      : satuan pembentuk koloni
P1         : jumlah koloni pada sampel pengenceran 10-6
P2         : jumlah koloni pada sampel pengenceran 10-5
P3         : jumlah koloni pada sampel pengenceran 10-4
KA      : kadar air tanah.
7.       Ukuran luas zone bening dari setiap koloni.
8.      Pindahkan koloni tersebut kemedia padat yang telah disediakan untuk permunian.


4.4  Hasil Dan Pembahasan





V. METODE MOST PROBABLE NUMBER (MPN)
5.1 Pendahuluan
Metode most probable number (MPN) memungkinkan kita untuk menduga populasi jazad mikro tanpa menghitung jumlah sel atau koloni. Metode ini juga sering disebut metode pengenceran. Metode MPN didasarkan pada penentuan ada tidaknnya jasad mikro didalam tempat inkubasi (tabung reaksi) yang dinokulasikan dengan suatu seri pengenceran suspenss tanah atau bahan lain.
            Syarat dari metode ini adalah jasad mikro yang ingin ditetapkan mempunyai sifat-sifat yang mudah dikenal dalam substrat. Dalam hal iniperubahan hasil reaksi yang positif menunjukan paling tidak satu jasad mikro dalam sampel tersebut pada waktu inkubasi.
5.2 Peralatan Dan Bahan
            Peralatan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah laminair flow, erlenmeyer, tabung reaksi, pipet, dab lampu bunsen. Bahan yang diperlukan adalah larutan fisiologis, media sesuai jasad mikro yang di teliti, dan alkohol.
5.3 Cara Kerja
1.      Siapkan seri pengenceran 10-1 sampai 10-7
2.      Pipet sebanyak tiga kali ulang 1 ML suspensi dari pengenceran 10-7 dan masukkan ke dalam tabung yang berisi medium cair yang cocok untuk inokulum yang diteliti.
3.      Lanjutkan untuk pengenceran 10-6, dan 10-5.
4.      Inkubasi tabung-tabung yang telah diinkulasi selama satu minggu.
5.      Pada akhir masa inkubasi, amati pertumbuhan jasad mikro pada setiap tabung dan catat jumlah tabung yang menunjukan pertumbuhan positif. Adanya pertumbuhan jasad mikro ditandai oleh adanya kekeruhan , pembentukan gas , dan gumpalan berbentuk cincin pada bagian atas tabung.
6.      Tentukan nilai MPN yang diperoleh berdasarkan Tabel 1.
7.      Hitung populasi jasad mikro dengan rumus :

Hasil MPN x tingkat pengenceran tertinggi x (100 + KA )/100



Tabel 1. Nilai MPN untuk tiga ulangan bagi setiap pengenceran (McCrady)(Verstraete, 1981 dalam Anas, 1989)

Hasil

MPN
Hasil
MPN
Hasil
MPN
000
0.0
201
1.4
302
6.5
001
0.3
202
2.0
310
4.5
010
0.3
210
1.5
311
7.5
011
0.6
211
2.0
312
11.5
020
0.6
212
3.0
313
16.0
100
0.4
220
2.0
320
9.5
101
0.7
221
3.0
321
15.0
102
1.1
222
3.5
322
20.0
110
0.7
223
4.0
323
30.0
111
1.1
230
3.0
330
25.0
120
1.1
231
3.5
331
45.0
121
1.5
232
4.0
332
110.0
130
1.6
300
2.5
333
140.0
200
0.9
301
4.0




5.4 Hasil dan Pembahasan.


VI. METODE MPN UNTUK PENETAPAN POPULASI NITROSOMONAS

6.1 Pendahuluan

Bakteri tanah yang mengoksidasi ammonium menjadi nitrit dan nitrat adalah bakteri yang bersifat khemoototrof. Pada tahap pertama , annonium diosidasi menjadi nitrit ileh bakteri kelompok nitrosomonas. Pada tahapan kedua, nitrit dioksidasi menjadi nitrat ileh bakteri nitrobacter. Kedua kelompok  bakteri ini disebut kelompok bakteri nitrifikasi.
            Sifat khemoototrof yang dimiliki oleh kedua bakteri ini digunakan untuk menghitung dan memisahkan mereka dari jasad mikro tanah yang lainnya. Nitrosomonas diinokulasi dalam medium organik yang mengandung ammonium sebagai sumber nitrogen. Bila ada Nitrosomonas tidak ada, karena ada kemungkinan ada bakteri lain yang dapat mengoksidasi atau ammonium menjadi nitrat.

6.2 Peralatan Dan Bahan.

            Peralatan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah laminair flow, erlenmeyer, tabung reaksi, pipet, dan lampu Bunsen. Bahan yang diperlukan adalah larutan fisiologis, media untuk nitrosomonas Lampiran 4, dan alkohol.

6.3 Cara Kerja

1.      Siapkan tanah sample dan buatlah seri pengenceran sampai tingkat 10-6
2.      Pipet sebanyak tiga kali ulang 1 mL suspensi dari pengenceran 10-6 dan masukkan kedalam tabung yang berisi medium cair yang cocok untuk iokulum yang diteliti.
3.      Lanjutkan untuk pengencean 10-5, dan 10-4.
4.      Inkubasi tabung – tabung yang telah diinkulasi selama 4 minggu.
5.      Pada akhir masa inkubasi , amati pertumbuhan jasad mikro pada setiap tabung dan catat jumlah tabung yang menunjukan pertumbuhan positif. Adanya pertumbuhan nitrosomonas ditandai oleh adanya perubahan warna menjadi kuning.
6.      Tentukan nilai MPN yang diperoleh berdasarkan Tabel 1.
7.      Hitung populasi jasad mikro dengan rumus :
Hasil MPN x tingkat pengenceran tertinggi x (100 + KA)/100

6.4 Hasil dan Pembahasan.


VII. METODE MPN UNTUK JASAD MIKRO PENGURAI PATI
7.1   Peralatan Dan Bahan.
Peralatan yang diperlukan dalam praktikum ini laminair flow, erlenmeyer, tabung reaksi, pipet, dan lampu bunsen. Bahan yang diperlukan adalah larutan fisiologis, media untuk jasad mikro pengurai pati ( lampiran 5 ), dan alkohol.

7.2  Cara Kerja

1.      siapkan tanah sampel dan buatlah seri pengenceran sampai tingkat 10-6
2.      pipet sebanyak tiga kali ulang 1 mL suspensi dari pengenceran 10-6 dan masukkan kedalam tabung yang berisi medium cair yang cocok untuk untk inokulum yang diteliti.
3.      Lanjutkan untuk pengenceran 10-5, dan 10-4.
4.      Inkubasi tabung-tabung yang telah diinkulasi selama seminggu.
5.      Pada akhir masa inkubasi tambahkan 2 tetes reagen jodium dan amati pertmbuhan jasad mikro pada setap tabung, serta catat jumlah tabung yang menunjukan pertumbuhan positif. Adanya pertumbuhan jasad mikro amilolitik ditandai leh tidak adanya warna biru. Warna biru menandakan bahwa pati tetap ada, berarti tidak ada bakteri amilolitik yang berkembang didalam tabung reaksi tersebut.
6.      Tentukan nilai MPN yang diperoleh berdsarkan Tabel 1.
7.      Hitung populasi jasad mikro dengan rumus :

Hasil MPN x tingkat pengenceran tertinggi x (100 + KA)/100
7.3 Hasil Dan Pembahan


VIII. RESPIRASI TANAH

8.1 Pendahuluan
            Respirasi tanah merupakan salah satu petunjuk aktivitas jasad mikro tanah, dengan mengukur CO2 yang dihasilkan atau O2 yang  dibutuhkan oleh jasad mikro tanah. Pengukur respirasi tanah, merupakan cara yang pertama kali digunakan untuk menentukan tingkat aktivitas jasad mikro tanah, alasannya adalah hasil yang diperoleh cukup peka, konsisten penetapannya sederhana dan cepat, serta tidak memerlukan alat yang sangat mahal dan canggih.
            Banyak sekali metode yang telah digunakan untuk menetapkan respirasi dalam penetapan CO2 secara kuantitatif, sebagaian metode ini berdasarkan penyerapan CO2 oleh basa. Basa yang paling sering digunakan KOH atau NaOH. Salah satu metode yang paling sederhana dan sering digunakan adalah verstraete.

8.2 Peralatan Dan Bahan.
            Pelatan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah beaker gelas/toples pastik kedap udara, buret, pipet, dan botol film. Bahan yang diperlukan adalah tanah lembab, KOH0,2 N, HC1 0,1 N, phenolptalin (PP), methyl orange, dan akuades.

8.3 Cara Kerja
1.       Tempatkan 100g tanah lembab didalam beaker gelas/toples plastik.
2.      Tempatkan 2 botol film yang berisi 10 mL akuades dan 5 mL KOH 0,1 N didalam beaker/toples yang berisi tanah
3.      Tutup rapat beaker/toples kemudian diinkubasi ditempat gelap selama 7hari.
4.      Buat blanko(tanpa tanah) dan diinkubasi ditempat yang sama.
5.      Pada akhir inkubasi, tabah 2 tetes larutan  PP kedalam KOH dalam botol film sampai terjadi perubahan warna menjadi pink.
6.      Selanjutnya dititrasi dengan larutan HC1 0.1 N sampai warna pink hilang, kemudian teteskan methyl orange sehingga timbul warna kuning.
7.      Titrasi kembali dengan HC1 0,1 N sampai terjadi perubahan warna dari kuning menjadi pink. Perubahan warna tidak terlalu kentara, oleh  karena itu harus hati-hati untuk menentukan titik akhir titrasi. Catat jumlah HC1 yang digunakan dalam titrasi kedua, karena berhubungan  langsung dengan jumlah CO2 yang difiksasi.
8.      Hitung kadar CO2 tanah lembab dengan rumus :


Mg C-CO2 Kg-1 tanah hari-1 = (s – b) x 0,1 x 120
                                                   n
 keterangan :
s  = mL HC1 titrasi substrat
b = mL HCL titrasi blanko.
n = jumlah hari inkubasi.

8.4 Hasil Dan Pembahasan





0 comments: